1绪论

1.1 MCs的物化特性及其毒性

1.1.1 MCs的物化特性

1.1.2 MCs的毒性

1.2 MCs的提取提纯及分析测定

1.2.1 MCs的提取提纯研究进展

1.2.2 MCs的分析测定研究进展

1.3 MCs污染的控制

1.3.1 物理法

1.3.2 氧化降解法

1.3.3 生物降解法

2研究内容及技术路线

2.1 研究目标

2.2 研究内容

2.2.1 菌种筛选及其生理生化特征研究

2.2.2 菌株的分子生物学鉴定

2.2.3 菌株降解MC-RR特性

2.2.4 基因USTB-05-A的克隆

2.2.5 基因USTB-05-A的表达

2.2.6 菌株降解MC-RR的第一步分子途径及机理

2.3 技术路线

3降解MC-RR菌株的筛选与生理生化特征

3.1 实验材料与仪器设备

3.1.1 蓝藻藻样

3.1.2 菌种来源

3.1.3 微生物培养基及培养条件

3.1.4 药品与试剂

3.1.5 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 MC-RR的分析测定

3.2.2 MC-RR提取提纯

3.2.3 菌种筛选

3.2.4 菌株细胞形态观察

3.2.5 菌株生长曲线的绘制

3.2.6 菌株耐盐性研究

3.2.7 菌株耐酸碱性研究

3.2.8 菌株抗生素抗性研究

3.3 MC-RR的提取提纯结果

3.4 菌种筛选结果

3.4.1 混合菌种筛选

3.4.2 纯菌种筛选

3.5 菌落形态观察及革兰氏染色

3.6 USTB-05的生长曲线

3.7 菌株USTB-05的耐盐性

3.8 菌株USTB-05的耐酸碱性

3.9 USTB-05对抗生素的抗性

3.10 本章小结

4菌株USTB-05的分子生物学鉴定

4.1 实验材料

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 培养基

4.1.3 PCR引物

4.1.4 药品与试剂

4.1.5 常用的生物信息分析的相关软件及网站

4.1.6 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 USTB-05基因组DNA的提取

4.2.2 PCR反应体系及步骤

4.2.3 琼脂糖凝胶电泳

4.2.4 目的基因的回收

4.2.5 目的基因与pGEM-T Easy载体连接

4.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞

4.2.7 质粒的提取

4.2.8 阳性克隆鉴定与测序

4.2.9 16S rDNA序列分析与菌属鉴定

4.3 USTB-05基因组DNA的提取结果

4.4 16S rDNA的PCR扩增结果

4.5 16S rDNA片段序列分析结果

4.5.1 去载体

4.5.2 BLAST搜索

4.6 系统发育树的绘制

4.7 本章小结

5 USTB-05对MC-RR的降解特性研究

5.1 实验材料

5.1.1 菌种与试剂

5.1.2 主要仪器

5.2 实验方法

5.2.1 溶解氧对USTB-05降解MC-RR的效应

5.2.2 温度对USTB-05降解MC-RR的影响

5.2.3 pH值对USTB-05降解MC-RR的影响

5.2.4 USTB-05菌株对MC-RR的降解

5.2.5 USTB-05菌株无细胞提取液（CE）制备

5.2.6 CE对MC-RR的降解

5.3 溶解氧的效应

5.4 温度的影响结果

5.5 初始pH值的影响结果

5.6 不同培养条件下USTB-05的生长情况

5.7 USTB-05菌株对MC-RR的降解

5.8 无细胞提取液对MC-RR的降解

5.9 本章小结

6基因USTB-05-A的克隆

6.1 实验材料

6.1.1 菌种

6.1.2 药品及试剂

6.1.3 主要溶液

6.1.4 主要仪器

6.2 实验方法

6.2.1 PCR获取USTB-05降解基因簇片段

6.2.2 DNA凝胶电泳

6.2.3 目的片段回收

6.2.4 目的片段与T载体连接

6.2.5 连接产物转化DH5α感受态细胞

6.2.6 质粒提取

6.2.7 阳性克隆鉴定及测序

6.2.8 反向PCR获取USTB-05未知序列

6.2.9 高保真PCR获取USTB-05菌完整降解基因

6.2.10 设计基因USTB-05-A克隆引物

6.2.11 PCR扩增、连接T载体、转化及鉴定

6.2.12 pGEX-4T-1载体获得

6.2.13 目的基因与pGEX-4T-1载体制备

6.2.14 重组质粒pGEX-USTB-05-A/BL21 （DE3）构建

6.2.15 阳性克隆鉴定及测序

6.3 降解MC-RR基因初步探索

6.4 反向PCR扩增未知序列

6.4.1 反向PCR扩增结果

6.4.2 序列分析拼接

6.5 高保真PCR获取USTB-05菌降解MC-RR完整基因

6.5.1 高保真PCR

6.5.2 序列拼接

6.5.3 获取开放阅读框（ORF）

6.6 PCR扩增USTB-05-A基因

6.7 克隆重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定

6.8 T Easy/ USTB-05-A测序结果

6.9 USTB-05-A基因与pGEX-4T-1载体双酶切

6.10 表达重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定

6.11 本章小结

7基因USTB-05-A的表达

7.1 实验材料

7.1.1 菌种及主要药剂

7.1.2 主要溶液

7.1.3 主要仪器

7.2 实验方法

7.2.1 SDS-PAGE检测蛋白质表达

7.2.2 USTB-05-A基因工程菌总蛋白提取及浓度测定

7.2.3 影响诱导表达单因素条件试验

7.2.4 最佳条件下的重组蛋白诱导表达

7.2.5 重组蛋白酶包涵体鉴定

7.2.6 重组蛋白酶的分离纯化

7.2.7 表达蛋白酶的活性验证

7.2.8 基因工程菌与USTB-05菌体降解MC-RR活性对比

7.3 影响表达量的单因素影响结果

7.4 最佳条件下重组蛋白酶诱导表达

7.5 包涵体验证结果

7.6 表达蛋白降解MC-RR活性验证

7.7 重组蛋白酶初步分离

7.8 USTB-05菌体与基因工程菌降解MC-RR活性对比

7.9 本章小结

8 USTB-05催化降解MC-RR第一步机理

8.1 实验材料

8.1.1 主要溶液

8.1.2 主要仪器

8.2 实验方法

8.2.1 重组蛋白酶对MC-RR的降解

8.2.2 MC-RR第一个降解产物质谱分析

8.3 重组蛋白酶对MC-RR的降解结果

8.4 MC-RR第一个降解产物质谱分析

8.5 USTB-05降解MC-RR第一步途径推测

8.6 本章小结

9结论与展望

9.1 主要结论

9.2 主要创新点

9.3 展望

参考文献

附录 USTB-05-A基因与mlrA基因序列