目录

1．绪论

1.1分子生物学与基因工程一瞥

1.1.1Watson和Crick的DNA模板学说

1.1.2Monod和Jacob的操纵子学说

1.1.3基因工程的工具酶和载体

1.1.4基因工程的基本程序

1.2基因工程与分子生物学进展一览

1.2.1基因工程的研究成就

1.2.2分子生物学的研究成就

1.3基因工程与分子生物学的发展趋势及展望

1.3.1蛋白质工程：改造基因、改造蛋白质、改造生命

1.3.2分子生物电子学的兴起以及不同学科的相互渗透

1.3.3走向海洋，走向宇宙空间

1.3.4大规模深入研究的重大战略部署

1.4不结束语

2．分子生物学实验室常规仪器设备

2.1实验室的基本要求

2.2.2水的净化装置

2.2实验室的常规仪器及设施

2.2.1温度控制系统

2.2.3消毒设备

2.2.4计量系统

2.2.5其它设备

2.3离心机室的装备

2.4分析仪器室的设置

2.4.1电泳装置

2.4.2层析装置

2.4.5DNA合成仪

2.4.6DNA测定仪

2.4.3光密度仪

2.4.4真空印迹系统

2.4.7PCR仪

2.5核素实验室

2.5.1放射性核素操作实验室

2.5.2放射性核素测定室

2.6细胞培养室

2.6.2温育和贮存区

2.6.1无菌操作设施

2.6.3观察和研究室

2.6.4清洗和消毒

2.7暗室

2.8冷室

3．分子生物学实验室常用技术

3.1核酸的纯化

3.1.1酚／氯仿抽提核酸溶液的制备

3.1.2酚的重蒸馏与水饱和

3.2.2丁醇抽提浓缩法

3.2核酸的浓缩

3.2.1固体聚乙二醇（PEG）吸水浓缩法

3.3核酸的沉淀

3.3.1核酸沉淀的盐类及浓度

3.3.2核酸沉淀的温度与时间

3.3.3离心力与离心时间

3.3.4有机沉淀剂

3.3.5核酸沉淀的操作方法

3.4.2荧光分光光度法测定核酸浓度

3.4.1分光光度法测定核酸的浓度

3.4核酸的定量

3.5核酸的贮存

3.6限制性内切酶及其应用

3.6.1限制性内切酶的功能、分类及命名

3.6.2限制性内切酶的数量单位及质量控制

3.6.3限制性内切酶酶解体系的建立

3.6.4限制性内切酶酶解中常见的问题和解决措施

3.6.5限制性内切酶的星号活力

3.6.6限制性内切酶的底物位点优势效应

3.6.7琼脂糖包埋完整染色体DNA的内切酶酶解

3.6.8限制性内切酶对单链DNA的切割

3.6.9限制性内切酶位点上的甲基化

3.7电泳

3.7.1原理

3.7.2影响电泳动率的四大因素

3.7.3核酸电泳的指示剂与染色剂

3.7.4电泳装置

3.7.5聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.7.6琼脂糖凝胶电泳

3.7.7脉冲场凝胶电泳

3.7.8双相电泳

3.8超速离心分离技术

3.8.1离心分离物质的原理

3.8.2超速离心的分类

3.8.3超速离心在核酸分离中的应用

3.9柱层析

3.9.1排阻层析

3.9.3羟基磷灰石柱层析

3.9.4离子交换层析

3.9.2亲和层析

3.9.5反相层析

4．核酸的分离与纯化

4.1核酸分离提取的原则

4.2真核细胞染色体DNA的制备

4.3质粒和噬菌体DNA的提取与纯化

4.3.1质粒DNA的提取与纯化

4.3.2质粒DNA的小量制备

4.3.3质粒DNA的大量制备

4.3.4质粒DNA的纯化

4.3.5噬菌体DNA的提取与纯化

4.4DNA片段的分离及纯化

4.4.1从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原则

4.4.2DEAE纤维素纸插片电泳法

4.4.3电泳洗脱法

4.4.4低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法

4.4.5玻璃粉末洗脱法

4.4.6琼脂糖凝胶中回收DNA片段的纯化

4.4.7聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段

4.5RNA的分离与纯化（真核细胞RNA的制备）

4.4.8蔗糖梯度超速离心分离DNA片段

4.5.1创造一个无RNase的环境

4.5.2RNA的提取方法

4.5.3mRNA的分离与纯化

5．核酸分子探针的标记

5.1概述

5.1.1探针的种类及其选择

5.1.2各种标记物及其选择

5.1.3放射性核素的探测

5.1.5各种标记方法及其选择

5.1.4放射性核素的卫生防护

5.2.1切口平移法

5.2探针的放射性核素标记法

5.2.2随机引物法

5.2.3单链DNA探针的标记

5.2.4cDNA探针的标记

5.2.5RNA探针的制备与标记

5.2.6DNA探针的末端标记

5.2.7寡核苷酸探针的标记

5.3非放射性标记法

5.2.8碘放射性核素标记法

5.3.1酶促标记法

5.3.2化学标记法

5.4探针的纯化

5.4.1凝胶过滤柱层析法

5.4.2反相柱层析法

5.4.3乙醇沉淀法

5.5探针比放射活性的测定

5.5.1三氯乙酸沉淀法

5.5.2DE-81滤膜吸咐法

6．核酸分子杂交

6.1膜上印迹杂交

6.1.1印迹技术

6.1.2固-液相杂交技术

6.1.3杂交信号的检测

6.1.4滤膜的重复使用

6.2液相杂交技术

6.2.1核酸酶S1保护分析法

6.2.2RNA酶保护分析法

6.3核酸原位杂交及其应用

6.3.1核酸原位杂交的基本原理

6.3.2核酸原位杂交的基本操作方法

6.4新技术简介

6.4.1亲和捕捉法

6.4.2夹心杂交法

6.4.3链取代法

7．基因克隆技术

7.1基因工程诞生的历史背景

7.2.1通过建立基因库分离靶基因

7.2基因克隆的策略与技术路线

7.2.2通过载体在适当宿主中扩增

7.3目的基因的来源与产生

7.4基因克隆的载体

7.4.1质粒载体

7.4.2λ噬菌体载体

7.4.3粘粒

7.4.4丝状噬菌体载体

7.4.5真核细胞的克隆载体

7.5DNA分子的体外连接

7.5.1DNA连接酶及连接机制

7.5.2DNA浓度对连接产物构型的影响

7.5.3DNA分子连接的策略与方案

7.5.4一种快速DNA连接技术

7.6重组子导入受体细胞

7.6.1概述

7.6.2转化方法

7.7.1针对遗传表型改变筛选法

7.7重组子的筛选与鉴定

7.7.2分析重组子结构特征的筛选法

7.8亚克隆技术

7.9高效率感受态细胞的制备

7.9.1感受态细胞制备的影响因素

7.9.2高效率感受态细胞制备方法

8．基因组文库

8.1构建基因组文库的载体

8.2.2几种λ噬菌体载体

8.2.1应用λ噬菌体构建基因组文库的基本步骤

8.2λ噬菌体载体

8.3载体DNA的制备

8.3.1载体DNA的酶解

8.3.2酶切后载体的再连接及包装后的滴度检测

8.3.3载体臂的纯化

8.3.4载体的脱磷处理

8.3.5LamdaGEMll／LamdaGEM12BamHI．XhoI酶切后载体臂的部分填充

8.4真核细胞DNA的制备

8.4.1几种染色体DNA的提取方法

8.4.2限制性内切酶部分酶解高分子量真核DNA

8.5.1连接浓度

8.5连接和包装

8.5.2连接条件的确定

8.5.3包装抽提物的制备和体外包装

8.6基因组文库的保存和扩增

8.7粘性质粒为载体的基因组文库

9．cDNA文库

9.1概述

9.1.1mRNA的分离

9.1.4cDNA与载体连接

9.1.2cDNA第一链的合成

9.1.3cDNA第二链的合成

9.1.5噬菌体的包装、转染及质粒DNA的转化

9.2cDNA库的构建

9.2.1mRNA分离

9.2.2第一链的合成

9.2.3第二链的合成

9.2.4cDNA的甲基化

9.2.5cDNA与连接子的连接

9.2.7cDNA的克隆

9.2.6cDNA的分部分离

9.2.8计算克隆效率

9.2.9cDNA库的扩增

10．DNA序列测定

10.1概述

10.1.1末端终止法

10.1.2化学裂解法

10.2末端终止法测定DNA核苷酸序列

10.2.1末端终止法所需的关键试剂

10.2.3大片段待测DNA片段的定向连续次级克隆

10.2.2末端终止法测定DNA序列方法的选择

10.2.4用噬菌体M13克隆待测DNA片段

10.2.5双脱氧末端终止法

10.2.6变性聚丙烯酰胺凝胶制备

10.2.7测序产物的凝胶电泳

10.2.8TaqDNA聚合酶催化的测序反应及凝胶的银染色法

10.3Maxam-Gilbert化学法测定DNA序列

10.3.1待测DNA的纯化

10.3.2碱基的特异性修饰及裂解

10.3.3测序图谱的识读

11.2.1ALFexpressTM全自动激光荧光核酸测序仪

11.2自动测序仪及操作原理

11．DNA序列的自动测定

11.1概述

11.2.2ABI最新型全自动DNA测序仪

11.2.3ABIPRISM310型全自动DNA测序仪（遗传分析仪）

11.3自动测序操作程序

11.3.1载体系统

11.3.2模板DNA的制备

11.3.3测序胶的制备

11.3.4测序模板DNA聚合酶延伸反应

11.3.6核苷酸顺序的阅读

11.3.5样品上样和电泳

11.3.7测序全程常见问题和解决办法

12．外源基因在原核细胞中的表达

12.1原核生物基因表达的特点

12.2外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件

12.2.1启动子

12.2.2SD序列

12.2.3终止子

12.3.1非融合型表达蛋白载体pKK223-3

12.3几种类型的原核表达载体

12.3.2分泌型克隆表达载体PINⅢ系统

12.3.3融合蛋白表达载体pGEX系统

12.4用于原核细胞表达的外源基因

12.5提高外源基因表达水平的措施

12.5.1提高翻译水平

12.5.2减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平

12.5.3提高表达蛋白的稳定性，防止其降解

12.6关于包涵体

12.7有关的实验

12.7.1外源基因的诱导表达

12.7.2细菌的裂解

12.7.3包涵体的分离

12.7.4包涵体的溶解和复性

12.8蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

12.9表达产物的免疫学及生物活性的检测

13.1.1胸苷激酶基因（tk）选择系统

13.1.2二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统

13.1哺乳动物基因转移的遗传选择标记

13．外源基因在真核细胞中的表达

13.1.3新霉素抗性选择系统

13.1.4氯霉素乙酰转移酶基因检测系统

13.2外源基因导入哺乳动物细胞的载体

13.2.1SV40载体

13.2.2其它病毒载体

13.3.1磷酸钙转染技术

13.3外源DNA导入哺乳动物细胞的方法

13.3.2电穿孔转染技术

13.3.3基因显微注射技术

13.3.4脂质体载体法

13.3.5DEAE-葡聚糖转染技术

13.4基因表达产物的检测

13.4.1免疫荧光抗体法检测表达蛋白

13.4.2免疫沉淀法检测表达蛋白

13.4.3Western印迹检测表达蛋白质

14.1.2甘油冻存法

14.1.1固体斜面法

14.1菌种保藏

14．基因工程菌的大规模培养

14.1.3冷冻干燥法

14.2工程菌培养

14.2.1影响工程菌生长和产物合成的因素

14.2.2工程菌培养方法

14.2.3参数检测与控制

14.2.4工程菌培养设备—发酵罐及其控制系统

14.2.5工程菌培养过程

14.3.1菌密度的测定

14.3工程菌培养中的主要分析方法

14.3.2发酵液中葡萄糖浓度的测定

14.3.3发酵液乙酸浓度的测定

15．工程菌生产的蛋白的复性与纯化

15.1包涵体的制备和溶解

15.2变性蛋白的纯化

15.3蛋白复性

15.3.1影响蛋白复性的因素

15.3.2蛋白复性方法

15.4蛋白复性的检测方法

15.4.2凝胶高压液相色谱法

15.4.1反相高压液相色谱法

15.4.3细胞测活法

15.5蛋白纯化

15.5.1蛋白纯化的方法

15.5.2蛋白纯化的操作方法

15.5.3层析柱的清洗

15.6蛋白含量测定

15.6.2Lowry法

15.6.3BCA法

15.6.1紫外分光光度法

16．动物细胞的大规模培养

16.1培养细胞的特性

16.1.1培养细胞的生长方式及类型

16.1.2培养细胞的生长特点

16.1.3培养细胞的生长过程

16.2培养细胞生长的条件

16.2.1细胞的营养需要

16.2.2细胞的生存环境

16.3.2培基的配制

16.3.1细胞培基和血清的选择

16.2.3无污染及无毒

16.3细胞培养的基本技术

16.3.3其他常用液体的配制

16.3.4原代培养

16.3.5传代培养和细胞系的维持

16.3.6细胞克隆

16.3.7细胞计数

16.3.8细胞的冻存与复苏

16.3.9细胞培养的污染及检测

16.4.1细胞培养规模的放大

16.4动物细胞大规模培养

16.4.2动物细胞培养生物反应器

16.4.3动物细胞微载体培养

16.4.4生物反应器的操作

17．多聚酶链式反应（PCR）技术

17.1PCR技术的原理

17.2PCR反应的成分和作用

17.2.1PCR反应的缓冲液

17.2.2底物（脱氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）浓度

17.2.6PCR反应的产物积累规律

17.2.5PCR反应条件的选择

17.2.3PCR反应的酶及其浓度

17.2.4引物

17.3PCR反应的自动化

17.4PCR反应引物设计

17.5耐热DNA聚和酶

17.6PCR反应模板的准备

17.7几种特殊的PCR

17.7.1锚定PCR

17.7.4多重PCR

17.7.3反向PCR

17.7.2不对称PCR

17.7.5着色互补PCR

17.8PCR技术的应用

17.8.1遗传性疾病的基因诊断

17.8.2PCR反应在检测艾滋病中的应用

17.8.3检测癌基因

17.8.4PCR在法医学上的应用

17.8.5PCR技术在分子生物学中的其它应用

18．DNA的化学合成

18.1DNA化学合成原理

18.2DNA的合成、纯化及鉴定

18.2.1DNA合成仪的操作

18.2.2DNA的切落及去保护

18.2.3寡核苷酸片段的纯化

18.2.4寡核苷酸片段的鉴定

18.2.5合成产物中DNA含量的测定

18.3DNA化学合成的应用

18.3.1DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用

18.3.2DNA合成在基因表达和调控方面的应用

18.3.3合成基因在医学中的应用

19．多肽的固相合成

19.1多肽合成原理

19.1.1液相多肽合成的简介

19.1.2固相多肽合成的简介

19.2固相多肽合成

19.2.1固相多肽合成的策略

19.2.2缩合反应

19.2.3反应的监测

19.2.4脱保护

19.2.5合成中应注意的问题

19.2.6肽从树脂上的裂解

19.2.7粗肽的纯化

19.3环肽的简介

19.4固相多肽合成

19.4.1实验材料

19.4.2第一个氨基酸与树脂的连接

19.4.3肽在树脂上的合成

19.4.4肽从树脂上的裂解

19.4.5脱盐

19.4.6纯化

19.4.7分析技术

19.5结束语

20．蛋白质氨基酸组成及序列测定

20.1蛋白质及肽的氨基酸组成分析

20.1.1实验前的准备：蛋白质水解

20.1.2氨基酸的测定

20.2.1蛋白质（肽链）的选择性裂解

20.2蛋白质N末端氨基酸序列测定

20.2.2肽段的分离、纯化

20.2.3肽段氨基酸顺序测定

21．真核基因表达调控

21.1真核基因表达调控基本理论

21.1.1真核基因结构功能特点

21.1.2真核基因表达调控的策略

21.1.3转录前的表达调控

21.1.4转录水平的调控

21.1.5转录后水平的调控

21.1.6翻译水平的调控

21.1.7翻译后水平的调控

21.2基因表达调控研究方法

21.2.1DNaseⅠ超敏感性分析

21.2.2DNA甲基化分析

21.2.3转录起始位点的测定（引物延伸法）

21.2.4体外转录

21.2.5进行中的核转录分析

21.2.6差示文库

21.2.7氯霉素乙酰转移酶分析

21.2.8凝胶滞留法

21.2.9滤膜结合法

21.2.10Southwestern印迹

21.2.11足纹法

21.2.12蛋白-核酸紫外交联法

21.2.13DNA结合蛋白的分离纯化

21.2.14编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的筛选

22．转基因动物

22.1转基因方法

22.2.1DNA影响基因转移的因素

22.2显微注射DNA的制备与纯化

22.2.2显微注射DNA样品的制备

22.3鼠的种类与饲养

22.3.1鼠的种类

22.3.2鼠的安置与饲养

22.4超排卵与取卵

22.4.1超排卵

22.4.2取卵

22.5.1制备持卵管与注射针

22.5显微注射

22.5.2显微注射操作

22.6卵的转移

22.6.1输卵管转移

22.6.2子宫移卵

22.7转基因鼠系的建立

22.7.1取鼠胚胎

22.7.3转基因鼠中外源DNA的分析

22.7.4转基因鼠系

22.7.2从胎鼠肌肉或幼鼠尾巴提取大分子量DNA

22.8卵培养液的配制与保存

22.8.1配制M2与M16的培养液的贮存液

22.8.2由贮存液配制M2

22.8.3由贮存液配制M16

22.9转基因动物的应用

22.9.1基因表达调控

22.9.2转基因动物模型

22.9.3用转基因动物生产生物活性物质与药物

23.1.1植物转基因基本技术

23.1转基因植物的基本技术与方法

23．转基因植物

23.1.2植物转基因方法

23.1.3根癌农杆菌Ti质粒表达载体

23.1.4植物组织培养和培养基

23.2.2原生质体的制备

23.2.3原生质体的转染

23.2.4报告基因产物的分析

23.2.1烟草悬浮细胞的培养

23.2PEG介导的原生质体转染

23.3根癌农杆菌介导的叶盘转化法

23.3.1烟草无菌苗的培养

23.3.2根癌农杆菌感受态的制备及其转化

23.3.3烟草叶盘共培养

23.3.4转化植株的筛选

23.3.5转化植株的田间移栽

23.4基因枪法转化愈伤组织

23.4.5水稻转化细胞的筛选

23.4.4轰击

23.4.6植株再生

23.4.2金粉制备

23.4.3微弹（microcarrier）制备

23.4.1水稻愈伤组织的诱导与培养

23.5病毒载体表达系统

23.5.1病毒cDNA的克隆和外源基因的插入

23.5.2体外转录

23.5.3重组病毒的小量制备

23.5.4病毒的大量繁殖和提纯

23.6转基因植株的分析

24．人类基因治疗

24.1基因治疗概述

24.2基因转移系统

24.2.1反转录病毒

24.2.2腺病毒

24.2.3腺病毒伴随病毒

24.2.4单纯疱疹病毒

24.3.1造血细胞

24.3受体细胞与转移基因的表达

24.2.5脂质体

24.2.6受体介导的蛋白

24.3.2肌肉细胞

24.3.3成纤维细胞

24.3.4肝细胞

24.3.5其它细胞

24.4人类基因治疗的审批程序

24.5基因标记与基因治疗

24.6.1腺苷脱氨酶缺陷

24.6遗传病基因治疗

24.6.2血友病

24.7肿瘤基因治疗

24.8伦理学安全性与社会效应

24.9问题与展望

25．体内外基因转移方法

25.1体内外基因转移方法概述

25.2体内外基因转移方法实例

26.1.2穿刺方法

26.1.1粒子轰击（基因枪）-RNA疫苗

26．非病毒载体基因治疗

26.1完全非病毒的基因转移方式

26.1.3超声介导的转染方法

26.1.4脂质体介导的大脑内连续转移基因

26.1.5DNA-合成蛋白（肽）复合物

26.1.6哺乳动物人工染色体

26.1.7厌氧细菌-梭状芽胞杆菌在癌症基因治疗中的应用

26.1.8抗体作为酶或基因的载体

26.2.2多瘤病毒的假衣壳作为载体

26.2.3噬菌体显示肽定向转移基因

26.2.1腺病毒的核内体溶解

26.2病毒增强的基因转移方式

27．细胞凋亡的研究方法

27.1细胞凋亡的形态学检测方法

27.1.1凋亡细胞的显微镜观察

27.1.2凋亡细胞的姬姆萨染色

27.1.3凋亡细胞的电子显微镜观察

27.1.4凋亡细胞的碘化丙啶（PI）排斥分析法

27.1.5双苯并咪唑染料（Hoechest33342）活细胞吸收分析法

27.1.6凋亡细胞对胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶敏感性分析法

27.2.1细胞群染色体DNA断裂的测定Ⅰ

27.2细胞凋亡的生物化学研究方法

27.2.2染色体DNA断裂的测定Ⅱ

27.2.3同时分析凋亡细胞染色体DNA断裂及其细胞形态法

27.2.4大分子染色体DNA断裂的测定

27.2.5细胞凋亡时钙离子浓度的测定

27.3细胞凋亡的免疫化学分析方法

27.4细胞凋亡的分子生物学研究方法

27.4.1过氧化物酶标记测定法

27.4.2荧光素标记测定法

27.4.3生物素-dUTP／酶标亲和素测定法

27.4.4Cy5-dCTP直接荧光标记法

28．微卫星技术

28.1微卫星技术概述

28.1.1概念

28.1.2微卫星技术基本特征

28.1.3微卫星产生机制

28.1.4微卫星标记的筛选

28.2.1扩增片段长度多态性

28.2微卫星多态标记检测技术

28.2.2荧光标记PCR法-采用373ADNA序列荧光标记自动分析仪

38.3统计分析

28.3.1不同人群之间等位基因频率计算

28.3.2人群中Hardy-Weinberg平衡推算

28.3.3推算突变率

29．cDNA末端快速扩增技术

29.1RACE的原理

29.2RACE的方法

29.3RACE的改良和优化

29.3.1反转录

29.3.2加尾反应

29.3.3PCR扩增和PCR产物的克隆

29.4RACE的其它应用及其前景

30．mRNA差异显示法

30.1mRNA差异显示法原理

30.2mRNA差异显示技术

31．DNA芯片技术

31.1DNA芯片的制作原理

31.2.1基因诊断

31.2.2应用DNA芯片技术分析基因组及发现新基因

31.2DNA芯片的应用

31.2.3DNA芯片用于基因表达的研究

31.2.4利用DNA芯片进行DNA序列分析

31.2.5利用DNA芯片技术进行后基因组研究

32．常用遗传统计分析方法

32.1Hardy-Weinberg定律

32.1.1常染色体基因的Hardy-Weinberg定律

32.1.2X-连锁基因的H-W定律

32.1.3近亲婚配和Hardy-Weinberg定律

32.2.1遗传多态性

32.2多态性

32.2.2基因频率

32.2.3样本取样随机性的验证

32.2.4多态性信息量计算

32.3多态性连锁分析

32.3.1连锁分析

32.3.2连锁相-单体型与重组

32.3.3连锁不平衡

32.4优势对数计分法与计算机程序

32.5关联分析

32.6传递不平衡检验

32.6.1只有一个孩子受累的家庭

32.6.2有两个孩子患病的家庭

32.6.3有两个以上受累同胞的家庭

32.7等位基因共享分析

32.7.1受累同胞对分析

32.7.2不一致同胞对

32.7.3受累亲属对分析

1．常用限制性内切酶酶切位点

附录

2．放射性核素数据

3．离心机转速与离心力的换算

4．核酸及蛋白质数据

5．分子克隆中使用的试剂与常用缓冲液的配制

6．常用贮存液的配制

7．常用酶的配制

8．常用层析数据

9．细菌培养基、抗生素和菌株

英汉分子生物学词汇

索引